每當(dāng)夏日將至，人們就開始陷入到被蚊子支配的恐懼之中，小小的蚊子不僅讓很多人飽受皮肉之苦，還會(huì)傳播瘧疾、登革熱、絲蟲病等危害性較強(qiáng)的傳染病。因此，別看人類處在食物鏈的頂層，可幾十年過去了，除了殺蟲劑策略，我們?nèi)匀粵]有什么一勞永逸的辦法對(duì)付蚊子。隨著CRISPR 基因編輯革命的爆發(fā)，人們開始將目光聚焦于基因驅(qū)動(dòng)，并期許借此系統(tǒng)改造蚊子、終結(jié)瘧疾。
近日，《Nature Communications》雜志發(fā)表了一篇題為 Optimized CRISPR tools and site-directed transgenesis towards gene drive development in Culex quinquefasciatus mosquitoes的文章，研究人員專為蚊子開發(fā)了一種Cas9/guide-RNA 表達(dá)“質(zhì)粒工具包”，以遏制“病媒”蚊子傳播病毒的能力。
https://doi.org/10.1038/s41467-021-23239-0
眾所周知，gRNA和Cas9核酸酶是CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的左膀右臂，gRNA可識(shí)別目的DNA序列，指導(dǎo)Cas9在特定序列進(jìn)行剪切，并依賴細(xì)胞本身的序列修復(fù)或外源基因的同源重組實(shí)現(xiàn)基因編輯，而基因編輯的特異性和位點(diǎn)選擇依賴于gRNA中特異性識(shí)別序列的不同設(shè)計(jì)。
由此可見，gRNA作為一類非編碼RNA對(duì)基因編輯至關(guān)重要，且需要III型RNA聚合酶通過轉(zhuǎn)錄方式合成。為此，如何快速地構(gòu)建含有III型RNA聚合酶啟動(dòng)子“U6啟動(dòng)子”的gRNA表達(dá)組件至關(guān)重要。
基于此，為了評(píng)估新建的CRISPR/Cas9基因編輯工具的工作效率，研究人員分別在體外和體內(nèi)環(huán)境中對(duì)在庫蚊中表達(dá) Cas9 和 gRNA 的“U6啟動(dòng)子”進(jìn)行功能驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，U6 啟動(dòng)子在體內(nèi)外的活性一致。
CRISPR 試劑在Culex quinquefasciatus卵巢細(xì)胞系中的驗(yàn)證
當(dāng)然，該“質(zhì)粒工具包”能否成為對(duì)付庫蚊的寶貴工具還需進(jìn)一步驗(yàn)證。據(jù)了解，Vasa基因被認(rèn)為是生殖細(xì)胞可信的分子標(biāo)記之一，在生殖系的起源、發(fā)育以及配子形成過程中發(fā)揮重要作用。為此，研究人員對(duì)vasa -Cas9轉(zhuǎn)基因活性進(jìn)行了功能評(píng)估。經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因中的vasa啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng) Cas9 在庫蚊生殖系中的有效表達(dá)。
vasa -Cas9 轉(zhuǎn)基因的表型、分子和功能驗(yàn)證
隨后，研究人員通過修改gRNA 結(jié)構(gòu)序列對(duì)Cas9/guide-RNA 表達(dá)的“質(zhì)粒工具包”進(jìn)行了優(yōu)化，并成功建立了Cas9 基因的轉(zhuǎn)基因品系。研究發(fā)現(xiàn)，這些優(yōu)化的gRNA可以顯著提升該工具包的基因驅(qū)動(dòng)效率。與此同時(shí)，科研人員思考這個(gè)新工具是否適合其他模型呢？
為此，研究人員評(píng)估了gRNA“Loop”支架變體對(duì)果蠅轉(zhuǎn)基因效率的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與“原始”gRNA相比，經(jīng)“Loop”修飾可顯著提高該工具的切割和轉(zhuǎn)換效率，并可能為其他物種的未來基因驅(qū)動(dòng)和基因編輯產(chǎn)品提供更好的思路。
gRNA 支架變體提高了黑腹果蠅的基因驅(qū)動(dòng)效率
總之，該突破性研究極大地革新了傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)。盡管仍然需要完善，一些倫理問題也仍需解決，但科學(xué)家們一直在不懈努力，致力于將這項(xiàng)技術(shù)發(fā)展得更為精準(zhǔn)及高效。未來，潛力無限的CRISPR技術(shù)將如何發(fā)展？讓我們拭目以待。
