簡介

胰蛋白酶(Trypsin),是胰臟分泌的一種絲氨酸肽鏈內切酶，可切割賴氨酸及精氨酸C末端形成的肽鍵。作為一種重要消化酶，胰蛋白酶廣泛應用于蛋白質的酶解/測序、組織/細胞的消化、胰島素的生產等各研究領域。在疫苗和病毒載體的研發和生產過程中，貼壁細胞的培養是其中的關鍵步驟。中國藥典(2020)在生物制品通則中將胰蛋白酶列為中等風險原料，因此對于涉及到用胰蛋白酶消化的工藝階段需要進行胰蛋白酶的檢測。

本試劑盒可檢測天然或重組的豬源胰蛋白酶，并做為胰蛋白酶殘留的評估，具有較高的檢測靈敏度與較寬的線性范圍。應用于生物制藥工藝開發、生產過程或產品原液的胰蛋白酶殘留檢測。

 本試劑盒僅用于科研和生產過程控制，不能用于人類和動物的醫學診斷。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心酶聯免疫檢測技術測定樣品中胰蛋白酶的微量殘留。

組分說明

使用方法

試劑準備

1.本試劑對水份敏感，在開瓶前，需將各組分小瓶平衡至室溫，以避免容器內的水份冷凝。

2.清洗液的配制：用蒸餾水或純化水10倍(1:9)稀釋試劑E清洗液(10X)，配制實驗用清洗液。長期使用可放于2℃~8℃保存，效期3個月。

3.設置酶標儀，讀取波長450nm/630nm的雙波長。

4.顯色液的配制：雙組份TMB顯色液由兩部分組成：組分A(含H2O2)和組分B(含TMB),分瓶包裝，臨用前按1:1混合后使用。

5.校準品的配制：取出試劑盒中的試劑A校準品(凍干品),加入1mL純水復溶混勻，混勻后按照下表與圖示，梯度稀釋至5000pg/mL,2000pg/mL,1000pg/mL,500pg/mL,200pg/mL,80pg/mL,32pg/mL,0pg/mL。

6.樣品的配制：

樣品可用所提供的試劑B稀釋液稀釋至檢測的線性范圍內，每個濃度點應起碼配制250μL。計算結果時，需將稀釋后的樣品濃度乘以稀釋倍數。

未提供的必需品

1.具有450nm和630nm雙波長檢測功能的酶標儀。 (如果酶標儀不能提供雙波長分析，也可以僅在450nm波長下讀取)。

2.移液器5-200μLg

3.多通道移液器100μL。

4.蒸餾水或純化水。

5.用于稀釋清洗液的500mL容器。

檢測操作步驟

1.取所需數量的組份H預包被酶標板條固定于板架上；向孔中加入校準品/待測樣品，每孔100μL,每個濃度兩個重復；

2.輕輕震蕩混勻，貼上封板膜，37℃孵育60分鐘；

3.洗板：甩凈孔中液體，在各反應孔中加入稀釋后的實驗用清洗液(由試劑E清洗液稀釋后配制),每孔300μL,停留5秒鐘后甩去孔中液體，重復3次后一次甩凈拍干。機洗：每孔中注液量為每孔300μL,洗板3次后一次拍干；

4.加入試劑C Biotin標記的檢測抗體，每孔100μL；

5.輕輕震蕩混勻，貼上封板膜，37℃孵育60分鐘；

6.洗板：甩凈孔中液體，在各反應孔中加入稀釋后的實驗用清洗液(由試劑E清洗液稀釋后配制),每孔300μL,停留5秒鐘后甩去孔中液體，重復3次后一次甩凈拍干。機洗：每孔中注液量為每孔300μL,洗板3次后一次拍干；

7.加入試劑D鏈霉親和素-辣根過氧化物酶復合物，每孔100μL；

8.輕輕震蕩混勻，貼上封板膜，37℃孵育60分鐘；

9.洗板：甩凈孔中液體，在各反應孔中加入稀釋后的實驗用清洗液(由試劑E清洗液稀釋后配制)每孔300μL,停留5秒鐘后甩去孔中液體，重復3次后一次甩凈拍干。機洗：每孔中注液量為每孔300μL,洗板3次后一次拍干；

10.顯色：加入試劑F顯色液，每孔100μL,20-25℃,避光孵育15分鐘；

11.終止：加入試劑G終止液，每孔100μL,終止反應(此時藍色立刻轉為黃色);

12.測定：用酶標儀在450nm/630nm雙波長下，讀取各孔的吸光值(O.D.值),如果酶標儀不提供雙波長分析，可以僅在450nm波長下讀取，測定應在加入終止液后15分鐘以內進行。

結果分析與計算

1.校準品、待測樣品均做2個重復，取其平均值。

2.用酶標儀的自帶軟件(通常是四參數邏輯曲線擬合)或使用能夠生成四參數邏輯擬合(log-4PL)的計算機軟件制作校準品劑量-反應曲線的回歸方程，再根據待測樣品的O.D.值從回歸曲線上返算出樣品中待測物的濃度。

3.請勿使用線性回歸分析來推導樣品濃度，避免導致結果不準。

4.含有大于5000pg/mL的樣品需用所提供的試劑B稀釋液稀釋后測定。計算結果時，需將稀釋后的樣品濃度乘以稀釋倍數。

檢驗方法的局限性

1.本品僅適用于Trypsin(豬源胰蛋白酶)殘留檢測。

2.樣品pH應保證在6.0-8.0之間，過低或過高的pH可能會造成測量值異常。

注意事項

1.本試劑盒適合由合格的技術人員操作使用。

2.將試劑盒從冷藏環境中取出并在室溫下平衡20分鐘后方可使用。

3.為了避免試劑、移液槍頭和平板的交叉污染，應使用一次性的移液槍頭和試劑容器。未用完的試劑不要重新倒回試劑瓶或試劑管中，注意不要把不同試劑瓶的蓋子弄混而造成交叉污染。

4.加樣：每次加樣的時間控制在5分鐘以內，推薦設置復孔，如果樣本數量多，推薦使用排槍加樣。

5.請于每次測定時，同時做標準曲線（復孔）。對于所有測定步驟，保持從一個孔到另一個孔的重復時間序列，以確保所有孔的孵育時間相同。且應盡可能快地完成所有步驟，以避免可能導致系統不準確的“運行結束”順序過程時差。

6.孵育：為防止樣品蒸發，實驗室必須使用封板膜，洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標板處于干燥狀態，嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

7.洗板：洗滌過程中孔中殘留的洗滌液應在吸水紙或無塵干布上拍干，請勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。

8.顯色：樣品數量較多，建議使用排槍，請定時觀察反應孔的顏色變化（比如每隔2分鐘），如果梯度已經明顯，可提前加終止液終止反應，以避免顏色過深，影響酶標儀讀數；室溫較低時，也可適當延長顯色時間，以高校準品濃度點的OD為2.0-2.5左右較佳。由于實驗人員操作習慣與實驗環境影響，本試劑盒的高OD值可能會有所差異，此為正常現象，顯色液請避光保存。

9.終止：終止試劑是酸性的，操作過程中需要格外注意，防止與皮膚和眼睛接觸。

10.讀板：上機讀數前要用干凈的紙巾輕輕擦拭酶標板底部，以清除殘留的液體和手指印，以免影響酶標儀讀數，讀板過程中OD630nm波長為校正波長，若儀器存在差異，也可用650nm代替630nm。