產品簡介

 胰蛋白酶(Trypsin)，是胰臟分泌的一種絲氨酸肽鏈內切酶，可切割賴氨酸及精氨酸C末端形成的肽鍵。作為一種重要消化酶，胰蛋白酶廣泛應用于蛋白質的酶解/測序、組織/細胞的消化、胰島素的生產等各研究領域。胰蛋白酶能夠催化底物水解，生成7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)，產物在Ex/Em=380/460nm可測量熒光強度，通過熒光強度(RFU)的變化即可表征胰蛋白酶的活性。本試劑盒可檢測樣品中的胰蛋白酶活性，也可以作為胰蛋白酶殘留的活性評估。與傳統的BAEE法或TAME法測定胰蛋白酶活性相比，本試劑盒具有更高的檢測靈敏度。

 實驗原理

胰蛋白酶活性測定試劑盒是一種胰蛋白酶裂解底物生成7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）的方法，在Ex/Em=380/460nm檢測熒光強度（RFU），由于熒光強度與AMC含量成正比，因此可以準確地測定胰蛋白酶的活性。

組分說明

未提供的必需品

1. 具有Ex/Em=380/460nm熒光檢測功能的酶標儀；

2. 移液器；

3. 蒸餾水或純化水；

4. 水浴鍋；

使用方法

試劑準備

1. 本試劑對水份敏感，在開瓶前，需將各組分小瓶于室溫下平衡20min方可使用，以避免容器內的水份冷凝。

2. 設置酶標儀，Ex/Em =380/460nm 

3. 配制底物溶液：用1mL蒸餾水或純化水復溶試劑B底物配制1mg/mL底物濃溶液，混合均勻，再加入1mL試劑A，充分混合均勻，如果使用不完，請分裝密封保存在-20℃,一個月內可以正常使用。

4. 配制樣品溶液：用試劑A稀釋液配制樣品溶液，推薦濃度為（2-100）ng/mL或（0.1-5）ng/孔（50μL）加樣量。

5. 配制質控品溶液：取2μL質控品加入5998μL試劑A稀釋3000倍。稀釋后的質控品溶液須在4小時內使用。

6. 校準品的配制：校準品的配制：由于試劑C校準品中的DMSO在-20℃下呈固體，即使是在室溫下也很難融化，因此需在使用試劑C前于37℃水浴中加熱1-5分鐘，使DMSO融化。然后按下述表格，將融化的試劑C和試劑A配制梯度濃度的校準品。注意：稀釋后的標準品須在4小時內使用！每次使用都要重新稀釋！

檢測操作步驟

1.取所需數量的酶標板條固定于板架上；向孔中依次加入校準品（6個濃度）/底物溶液，50μL/孔，每個檢測兩個重復；

2.向每孔中加入試劑A/質控品/樣品溶液，50μL/孔，充分混勻；加樣可參考下表說明；

3.檢測：Ex/Em=380/460nm，檢測熒光強度（RFU）溫度設置在25℃，立即計時，用動力學模式進行檢測，每0.5min測一次。連續檢測10分鐘；

4.在線性范圍內熒光強度的變化率應恒定，選擇兩個時間點（T1和T2），呈線性關系不得少于3分鐘，來計算樣品中的胰蛋白酶活性；

5.若變化率不能保持恒定，可用較低濃度另行測定。

結果分析與計算

1.在線性范圍內（熒光強度的變化率應恒定），選擇兩個時間點（T1和T2），呈線性關系不得少于3分鐘，來計算樣品中的胰蛋白酶活性；

2.每個標準品和樣品的重復讀數取平均值；

3.將每個標準品的平均熒光強度作為AMC濃度的函數繪制出來；

4.計算樣品活性：

1）S1是時間T1（min）時的樣品熒光強度讀數（RFU），S2是時間T2（min）時的樣品熒光強度讀數（RFU），M（mg）：每孔中含胰蛋白酶的質量；

2）由S1的熒光強度（RFU）根據AMC校準曲線，線性擬合推導出AMC的量C1（nmol），由S2的熒光強度（RFU）根據AMC校準曲線，線性擬合推導出AMC的量C2（nmol）；

3）質控品與樣品溶液中胰蛋白酶的活性計算公式為：

胰蛋白酶活性（mU）=（C2(nmol)-C1(nmol)）/（T2(min)-T1(min)）

或

（mU/mg）=（C2(nmol)-C1(nmol)）/[（T2(min)-T1(min)）×M(mg)]

4）當樣品的熒光強度（RFU）大于較高濃度的標準品熒光強度時應用試劑A稀釋液進一步稀釋樣品，并重新分析。

結果的解釋

1. 1U（AMC法）表示為胰蛋白酶在25°C下每分鐘可以裂解底物產生1μmol的AMC(μmol/min)。

2. 1U（AMC法）=1.7U（BAEE法）

注1）酶活（BAEE法）定義：25℃，pH7.6,反應體系3.2mL（25px光路），每分鐘酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.003定義為一個USP單位。注2）BAEE=N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽，分子式：C15H22N4O3.HCl

結果的換算

若已知樣品的比活（每毫克酶所具有的酶活力，一般用U/mg表示），可由檢測樣品的活性推導殘留的質量或濃度，舉例如下：

已知檢測結果：1mU/孔（AMC法），樣品的比活：1mg=38000U（BAEE法），每孔體積50μL，可得：

1）檢測結果的活性換算（每孔）：活性（AMC法）×1.7=活性（BAEE法），即：1mU（AMC法）=1.7mU（BAEE法）

2）檢測結果的質量換算(每孔)：活性（BAEE法）/比活=1.7mU（BAEE法）/38000U=4.47×10-8mg=44.7pg

3）檢測結果的濃度換算：濃度=每孔質量/每孔體積，即：44.7pg/50μL=0.894ng/mL

4）樣品的濃度：若樣品經過稀釋，計算結果時，需將稀釋后的樣品濃度乘以稀釋倍數。

檢測的局限性

1.下列化學物質或生物材料會干擾檢測，導致結果下降或失效，適當稀釋樣品會降低干擾的影響，用試劑A稀釋液配制樣品溶液，推薦濃度為（2-100）ng/mL或（0.1-5）ng/孔（50μL加樣量）。

1）胎兒或小牛血清（作為細胞培養基的組分），會抑制胰蛋白酶的活性。

2）RIPA：含有SDS，可以破壞/降低酶的活性。

2.樣品制備過程中，請勿使用蛋白酶抑制劑，避免干擾分析。

檢測范圍

0.002-1mU（AMC法）也可換算為0.0034-1.7mU（BAEE法）

注意事項

1.本試劑盒適合由合格的技術人員操作使用。

2.將試劑盒從冷藏或冷凍環境中取出并在室溫下平衡20分鐘后方可使用。

3.為了避免試劑、移液槍頭和平板的交叉污染，應使用一次性的移液槍頭和試劑容器。未用完的試劑不要重新倒回試劑瓶或試劑管中，注意不要把不同試劑瓶的蓋子弄混而造成交叉污染。

4.本試劑盒中的試劑不能與其他批次或其他來源的試劑混合使用。

5.本試劑盒僅用于科研和生產過程控制，不能用于人類和動物的醫學診斷。